在線凈化與固相萃取的比較-簡(jiǎn)單/方便

http://www.thermo.com.cn/Resources/201104/29123547853.pdf

在線凈化LC-MS/MS
系統(tǒng)對(duì)動(dòng)物組織中克倫特羅殘留的檢測(cè)分析
趙孔祥1 王海鑒2
1. 天津出入境檢驗(yàn)檢疫局食檢中心；2. 賽默飛世爾科技（ 中國(guó)） 有限公司
克倫特羅俗稱瘦肉精，常被用作飼料添加劑以提高家
畜的瘦肉含量，但由于其嚴(yán)重的毒副作用，歐盟于1988
年1 月1 日起禁止鹽酸克倫特羅物質(zhì)當(dāng)飼料添加劑使用。
1991 年被FDA 禁止。1997 年，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部下
文嚴(yán)禁β- 腎上腺素類激素在飼料和畜牧生產(chǎn)中使用，鹽酸
克倫特羅列為*位。2009 年7 月為應(yīng)對(duì)日、韓從我國(guó)食
品中檢出鹽酸克倫特羅事件，質(zhì)檢系統(tǒng)確定了了更嚴(yán)格的
出口判定標(biāo)準(zhǔn)（0.05μg/kg），食品檢測(cè)已經(jīng)進(jìn)入超痕量時(shí)代。
在此背景下，我們需要更有效的前處理手段以便我們
得到更加濃縮更加純凈的樣品來(lái)提高我們的信號(hào)降低我
們的噪音?；谏V原理的創(chuàng)新樣品制備方法——Turbo
Flow 技術(shù)為我們提供了新的思路。這種在線自動(dòng)過程處理
技術(shù)結(jié)合了擴(kuò)散、化學(xué)和體積排除的原理，在捕獲感興趣
分析物的同時(shí)，快速消除基質(zhì)干擾。本實(shí)驗(yàn)旨在建立一個(gè)
前處理簡(jiǎn)單，選擇性靈敏度高的克倫特羅的Turbo Flow 實(shí)
用在線凈化方法，并確定該方法的檢出限。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 樣品制備
取5g 動(dòng)物組織樣品與10mL 乙腈，10% 乙酸銨（1:3）
混合溶液混勻勻漿10 分鐘，5000r/min 離心十分鐘取
1mL 上清液經(jīng)過0.22μm 注射過膜，上機(jī)。
1.2 Turbo Flow 條件
系統(tǒng)：
Thermo Scientific Aria
TLX-1 controlled by Aria. software
在線凈化柱： Turbo Flow Cyclone MCX 0.5×50mm
進(jìn)樣體積： 50μL
上樣溶劑： 0.1% 的甲酸水溶劑
上樣流速： 2mL/min
洗脫溶劑： 1%的氨水甲醇溶液
洗脫體積： 50μL
1.3 HPLC 方法條件
色譜柱：Hypersil GOLD aQ 3μm 100 X 2.1mm
流路A ：0.1% 的甲酸水溶液
流路B ：甲醇
時(shí)間（min） A% B% 流速mL/min
0 90 10 0.4
1 90 10 0.4
2.33 80 20 0.4
2.83 60 40 0.4
6 10 90 0.4
6.5 10 90 0.4
8 90 10 0.4
1.4 質(zhì)譜條件
1.4.1 調(diào)諧參數(shù)
系統(tǒng) TSQ Ultra AM
離子源極性： 正離子模式
噴霧電壓： 4500V
鞘氣壓（N2）： 50arb
輔助氣壓（N2）： 16arb
毛細(xì)管柱溫度： 350°C
碰撞氣體（Ar）： 1.5mTorr
Skimmer offset 10V
Q1/Q3峰分辨度： 0.7u （單位質(zhì)量）
1.4.2 SRM 反應(yīng)參數(shù)
被分析組分
母離子
（m/z）
子離子
（m/z）
碰撞能量
（V）
管透鏡電壓
（V）
克倫特羅-D9 286 169.1 28 104
克倫特羅277 132.2 29 94
168.1* 28 94
203.6 15 94
* 為定量離子
2 結(jié)果與討論
食物樣品本身基質(zhì)比較復(fù)雜，在進(jìn)行檢測(cè)之前往往
需要一個(gè)較長(zhǎng)的樣品預(yù)處理過程。比如賈曉飛等使用酶
解，高氯酸沉淀蛋白，邵兵等應(yīng)用HLB 和MCX 兩次SPE
對(duì)食品中β2- 受體激動(dòng)劑進(jìn)行殘留檢測(cè)都取得了很好的效
果，這些方法的目的也都是為了獲得更加濃縮和純凈的樣
品。應(yīng)用Turbo-Flow 在線凈化技術(shù)使得這些工作變得更加
圖1 Turbo Flow 在線凈化與HPLC 聯(lián)用方法參數(shù)
熱點(diǎn)聚焦 Hotspot
簡(jiǎn)潔方便，減少了中間步驟和偶然誤差，使得加標(biāo)回收的
重復(fù)性很穩(wěn)定，0.05μg/kg 濃度下六平行RSD 為5.36% ；
同時(shí)由于樣品更加純凈濃縮，干擾較少，此方法在添加量
為0.02μg/kg 濃度下峰型良好（ 如圖2 所示）。根據(jù)歐盟
法規(guī)計(jì)算此方法檢出限（LOD） 為0.002μg/kg，定量限為
0.006μg/kg 已經(jīng)能輕松應(yīng)對(duì)實(shí)際需要。同時(shí)如果有實(shí)際
需要，可以采用更長(zhǎng)的凈化柱（100mm 規(guī)格） 或者采用串
聯(lián)凈化柱的方法進(jìn)一步增加樣品濃縮倍數(shù)，來(lái)提高檢出限。
由于采用了在線凈化系統(tǒng)，進(jìn)入分析色譜柱的樣品也更
圖2 0.02μg/kg 濃度色譜圖
圖3 20pg/g 添加回收比較圖。左圖為MCX 固相萃取凈化，右圖為在線凈化結(jié)果
為純凈，一定程度上降低了噪音和雜峰的產(chǎn)生。如圖3 所示，
采用Turbo Flow 技術(shù)一定程度上起到了穩(wěn)定基線的作用。
運(yùn)用Transcend 在線凈化系統(tǒng)的操作軟件Aria OS 的
變量設(shè)置功能，可以方便設(shè)置批處理程序嘗試不同的洗
脫溶液。在比較不同濃度的氨水甲醇溶液后，結(jié)果表明
1% 的氨水甲醇溶液作為洗脫溶液的效果*。使用外
標(biāo)法計(jì)算其與不經(jīng)過凈化柱的結(jié)果得到其回收率為
79%~84%。而且此濃度的氨水甲醇溶液以0.2mL/min 的
速度與0.4mL/min 的分析柱溶液混合不會(huì)對(duì)液相色譜
產(chǎn)生不良影響，在使用此方法千針后，10 個(gè)平行的保留
時(shí)間RSD 仍然只有0.1%。
分別配置5pg/mL，10pg/mL，20pg/mL，50pg/mL，
100pg/mL，200pg/mL，500pg/mL，1ng/mL，2ng/mL
的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中都混有100pg/mL 內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)
法定量得到標(biāo)準(zhǔn)曲線有很好的線性（ 曲線見圖3），相關(guān)系
數(shù)R2 為0.9995
向5g 動(dòng)物組織中分別添加100pg、250pg、500pg
克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)標(biāo)法定量，計(jì)算其回收率結(jié)果表明，經(jīng)
過在線凈化和內(nèi)標(biāo)法校正后樣品回收率非常穩(wěn)定。簡(jiǎn)單的
前處理步驟帶來(lái)zui少的偶然誤差。
表1 克倫特羅不同添加水平回收率
添加水平平均回收率% RSD%*
20pg/g 94.2 5.58
50pg/g 96.5 5.36
100pg/g 94.4 2.49
* 為六平行水平下RSD 值
3 結(jié)論
采用Turbo Flow 在線凈化技術(shù)可以非常方便的按要求
得到更加濃縮，干擾更少的樣品，提高了信噪比，降低了
檢出限。
Turbo Flow 圖4 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線在線凈化技術(shù)簡(jiǎn)化了前處理步驟，減少了
熱點(diǎn)聚焦 Hotspot
偶然誤差獲得了令人滿意的重現(xiàn)性。
使用Aria OS 操作系統(tǒng)，我們可以很方便的設(shè)置批處
理變量，嘗試不同種類或者比例的上樣或者洗脫溶劑。
4 參考文獻(xiàn)
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